Cómo contar moléculas usando proteínas fluorescentes

Para comprender el funcionamiento de las proteínas es fundamental saber cuántas se unen entre sí a escala nanométrica. Además, algunas deben encontrarse en un estado oligomérico –con determinados radicales asociados– para ser funcionales, aunque la ‘oligomerización’ también puede conducir a enfermedades.

Determinar la estequiometría –proporciones entre reactivos y productos– de las proteínas y seguir los cambios en el equilibrio entre las monoméricas (con una unidad), diméricas y multiméricas ayuda a los científicos ver las diferencias entre una célula sana y otra enferma.

Ahora, el grupo de investigación de biofisica e imagen de fluorescencia avanzada del Instituto de Ciencias Fotónicas (ICFO) ha cuantificado la eficiencia de fotoactivación de todas las ‘proteínas fluorescentes fotoactivables irreversibles’ y establecido un marco de referencia para determinar la estequiometría de las proteínas.

El equipo, dirigido por la doctora Melike Lakadamyali, utilizó un nanopatrón de estequiometría conocido (el receptor de glicina humano, expresado en ovocitos de Xenopus) para estudiar varias proteínas fluorescentes y conocer el porcentaje de proteínas que se fotoactivaron. Los resultados se publican en Nature Methods.

En los últimos años el ‘conteo molecular’ ha avanzado gracias al descubrimiento de las proteínas fluorescentes fotoactivables y el desarrollo de la microscopía de superresolución. Las proteínas fluorescentes fotoactivables cambian sus propiedades de fluorescencia de oscuro a brillante cuando son expuestas a la luz (por ejemplo, luz láser).

Pero este conteo no es fácil por, entre otras razones, porque hasta no hace mucho no se sabía si todas las proteínas fluorescentes se volvían brillantes al ser expuestas al láser. El fallo en no fotoactivarse conlleva a contar una menor cantidad de proteínas, ya que aparecerían oscurecidas y nunca resaltarían en la imagen.

El equipo ha determinado que proteínas son las más adecuadas para el conteo molecular

Pero al medir la eficiencia de fotoactivación, así como otros factores fotofísicos como el ‘parpadeo’, el grupo pudo determinar que proteínas son las más adecuadas para el conteo molecular y encontró que ninguna es perfecta. Por tanto,  el estudio destaca la importancia de la eficiencia de fotoactivación para interpretar correctamente la información cuantitativa en el conteo de proteínas.

Lakadamyali señala: “Actualmente estamos trabajando con proteínas fluorescentes imperfectas. Sin embargo, al existir ahora una manera robusta para caracterizar la eficiencia de fotoactivación, el futuro trabajo de ingeniería de proteínas fluorescentes probablemente se centrará en la optimización de este parámetro para generar proteínas fluorescentes más adecuadas en el conteo molecular utilizando técnicas de superresolución».

El equipo combina varias técnicas de imagen vanguardistas a nivel de una sola molécula para estudiar como la organización de proteínas, su dinámica y estequiometría se vinculan al funcionamiento de proteínas en procesos biológicos fundamentales, como el transporte intracelular, los trastornos neurológicos autoinmunes o la reprogramación de células madre.

Referencia bibliográfica:

Nela Durisic, Lara Laparra-Cuervo, Ángel Sandoval-Álvarez, Joseph Steven Borbely, Melike Lakadamyali. “Single molecule evaluation of fluorescent protein photoactivation efficiency using an in vivo nanotemplate”. Nature Methods. Doi: 10.1038/nmeth.2784

 

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