Hoy se reconoce que la fosforilación reversible de proteínas modula muchos procesos celulares, incluyendo eventos del ciclo celular, respuesta a factores de crecimiento, hormonas y otros estímulos ambientales, control metabólico y procesos de desarrollo (Andreeva y Kutuzov, 1999; Chernoff, 1999; den Hertog, 1999; Iten et al., 1999; Schillace y Scout, 1999; Luan, 2003). Los cambios en el estado de fosforilación de proteínas están regulados por dos tipos de actividades enzimáticas: aquéllas catalizadas por las cinasas, la cuales unen covalentemente un grupo fosfato a un aminoácido de la cadena, y las fosfatasas que tienen la función inversa (Figura 1).
Figura 1. Proceso de fosforilación/desfosforilación de proteínas.
La unión o remoción del grupo fosfato de una proteína puede tener profundos efectos sobre la actividad y propiedades de esta proteína. Por ejemplo, la fosforilación de proteínas permite la regulación de las actividades enzimáticas, mediante cambios alostéricos conformacionales o bloqueando directamente el acceso al sitio catalítico de la enzima (Luan, 2003).
a) Clasificación de las fosfatasas
a.1) Por su pH óptimo de catálisis. Las fosfatasas (fosfomonoesterasas) es un amplio grupo de enzimas que están involucradas en la degradación de compuestos orgánicos de P a ortofosfato y así hacerlo disponible tanto para las plantas como para los microorganismos.
Cuadro 1. Factores de trascripción de algunos sistemas vegetales, que son fosforilados/desfosforilados (Sopory y Munshi, 1998).
Existen fosfatasas ácidas con actividades óptimas a pHs por debajo de 7.0, llamadas fosfatasas ácidas. Por otro lado, existen fosfatasas con actividades óptimas a pH alcalinos (7.5 – 11.0), denominadas por lo tanto fosfatasas alcalinas. En el ciclo del fósforo (en suelo), la hidrólisis de los grupos fosfatos gracias a las fosfatasas, tanto ácidas como alcalinas, es un proceso importante para las plantas.
Las fosfatasas ácidas son producidas por las raíces de las plantas, para así poder disponer del fósforo presente en el suelo; también son producidas por células animales y por microorganismos. Por otro lado, las fosfatasas alcalinas sólo se han encontrado en células animales y en microorganismos.
a.2) Por el residuo que desfosforilan. El papel de las fosfatasas en los mecanismos de modificación posttraduccional ha sido ampliamente documentado. Mientras que las proteínas cinasas estan estructuralmente relacionadas unas con otras. Las proteínas fosfatasas se encuentran agrupadas en al menos tres distintas familias (Cuadro 2). La familia PPP y PPM consisten de fosfatasas de Ser/Thr y la familia de las proteínas fosfatasas de Tyr (PTPasas), que incluyen tanto fosfatasas específicas de tirosina, como fosfatasas de especificidad dual, las cuales pueden desfosforilar residuos de Ser, Thr y Tyr (Luan, 2003). Un rasgo característico de las fosfatasas de Ser/Thr es que son metaloenzimas, ya que todas ellas cuentan con iones metálicos en su sitio activo (Mn2+ y Fe2+/ Fe3+ en el caso de PP1 y Zn2+ y Fe2+/ Fe3+ en el caso de PP2B) (Luan, 2003). Además, elementos de una misma familia pueden tener significativas diversidades estructurales, que pueden generarse por la presencia de una sóla o varias subunidades regulatorias unidas a la subunidad catalítica. Estas subunidades regulatorias, pueden localizar al complejo proteínico en un compartimiento subcelular específico, modular la especificidad por el sustrato o alterar la actividad catalítica.
Tradicionalmente las fosfatasas de Ser/Thr se han dividido en dos grandes grupos basándose en sus especificidades por algún sustrato y por sus propiedades farmacológicas. Así, tenemos al tipo 1 (PP1) y al tipo 2 (PP2A, PP2B y PP2C); la división de las fosfatasas del tipo 2 se basa en su dependencia por algún catión divalente. Mientras que PP2B y PP2C requieren Ca2+ y Mg2+, respectivamente; PP2A y PP1 son activas en ausencia de cationes divalentes. Dos pequeños péptidos (I1 e I2), así como un grupo de drogas, incluidos el ácido okadaico, caliculina A y cantaridina, son empleados para distinguir entre los miembros de las fosfatasas del tipo 1 y 2. Por ejemplo, el ácido okadaico, la microsistina LR, así como la caliculina A son potentes inhibidores de la PP1 y PP2A (Gehringer, 2004), los cuales pueden probocar cambios drásticos en las actividades de estas enzimas y así afectar procesos celulares importantes; pero no son efectivos contra PP2B y PP2C. La cantaridina sólo inhibe a la PP2A, pero no a las demás. Estos agentes se han usado como herramientas muy útiles para definir funciones celulares de estas enzimas en varios sistemas vivos, desde mamíferos hasta plantas (Luan, 2003).
Cuadro 2. Proteínas fosfatasas y su distribución en levaduras, plantas y animales (Luan et al., 2001; Luan, 2003).
Este simple sistema de clasificación se ha usado por décadas, pero actualmente se están empleando análisis estructurales de secuencia. Estos estudios sugieren que las fosfatasas PP1, PP2A y PP2B están estrechamente relacionadas y por eso se agrupan en la familia PPP, mientras que la PP2C, piruvato deshidrogenasa fosfatasa y algunas otras fosfatasas dependientes de Mg2+, están más relacionadas entre sí y por eso se agrupan en la familia PPM.
Aunque las fosfatasas de la familia PPP (PP1, PP2A y PP2B) poseen una región catalítica común, de aproximadamente 280 aminoácidos, muestran divergencias cuando se comparan sus dominios no catalíticos N- y C-terminal. Estas enzimas se distinguen por su capacidad de asociarse con subunidades regulatorias para formar una variedad de holoenzimas. Por otro lado, también las fosfatasas de la familia PPM muestran cierta homología entre ellas, aunque en menor porcentaje que las fosfatasas de la familia PPP y también son muy diversas en sus secuencias de los dominios N- y C-terminal (Figura 2), (Luan, 2003).
Figura 2. Dominios estructurales de las fosfatasas de Ser/Thr. Todos los miembros de la familia PPP tienen un dominio catalítico de 280 aminoácidos. La secuencia de este dominio es altamente conservada entre los miembros (40 – 60% de homología). Los miembros de la familia de las PP2C tienen un dominio catalítico que es menos conservado (20 – 35% de homología) (Luan, 2003).
En animales, la PP1 se encuentra involucrada en múltiples funciones celulares. Estos procesos son regulados por diferentes holoenzimas, en las cuales la misma subunidad catalítica (PP1c) forma complejos con distintas subunidades regulatorias y blancos (Figura 3), (Luan, 2003). En plantas, PP1 es exclusivamente citosólica en hojas de chícharos y en células de zanahoria, mientras que la PP1 de trigo esta asociada a los microsomas (Sopory y Munshi, 1998). De manera similar que la PP1, las diversas funciones de la PP2A son atribuidas a la presencia de al menos 15 subunidades B regulatorias, que se unen de manera individual con el núcleo del heterodímero que forma una subunidad catalítica (PP2Ac) de 36 kDa y una subunidad A regulatoria de 65 kDa (Figura 3), (Sopory y Munshi, 1998; Luan, 2003). La PP2B es una fosfatasa dependiente de Ca2+/Calmodulina. Esta holoenzima contiene una subunidad catalítica A y una subunidad regulatoria B (Figura 3). La subunidad catalítica A contiene varios dominios estructurales únicos, además de una región catalítica central que contiene el dominio de interacción con B, el sitio de unión a calmodulina y un dominio autoinhibitorio. La subunidad B es una proteína que, al unirse a la calmodulina, permite la percepción de Ca2+. Cuando el Ca2+ citosólico aumenta a concentraciones micromolares, la calmodulina se une al heterodímero A-B y activa la fosfatasa (Figura 3) (Klee et al., 1998).
Figura 3. Subunidades y regulación de las fosfatasas de la familia PPP. PP1 es un heterodímero compuesto por una subunidad catalítica PP1C y una subunidad regulatoria R. PP2A puede existir en forma heterodimérica o heterotrimérica. PP2B también puede encontrarse como un heterodímero con baja actividad (subunidad catalítica CnA y regulatoria CnB) en niveles bajos de calcio. Elevando los niveles de calcio se une la calmodulina (CaM) al heterodímero, para formar una enzima trimérica de alta actividad (Luan, 2003).
El mecanismo de desfosforilación para las PPPs implica un sólo paso con un metal activado por una molécula de agua o un ion hidroxido (Luan, 2003).
Las fosfatasas de la familia PPM, de la cual la PP2C es la enzima representativa, que se pueden encontrar tanto en procariotes como en eucariotes. Aunque las secuencias primarias de la PP2C y de otros miembros de la familia PPM no muestran mucha homología con las enzimas de la familia PPP, tienen similitudes estructurales, predominantemente en el sitio catalítico (Figura 4). El mecanismo de desfosforilación de las fosfatasas de la familia PPM es el mismo que se ha propuesto para las fosfatasas de la familia PPP.
Figura 4. Estructuras terciarias de fosfatasas de Ser/Thr. (A) Fosfatasa PP2C humana. (B) Fosfatasa PP1c con inhibidor 1.
Empleando sustratos para fosfatasas de animales y los mismos agentes farmacológicos (ej. ácido okadaico), se han encontrado fosfatasas de la familia PPP, tales como la PP1 y PP2A en plantas como Brassica napus, chícharo, zanahoria y maíz. La actividad de fosfatasas de la familia de las PP2C también se ha encontrado en plantas, y ya que esta fosfatasa requiere Mg2+ para su actividad, muchos de los estudios de desfosforilación dependientes de Mg2+ se usan para detectar este tipo de fosfatasas. A diferencia de la PP1 y PP2A, la PP2C, parece estar mayormente presente en fracciones citosólicas de las plantas. La PP2B también se ha encontrado en extractos de células guarda de Vicia faba (Luan, 2003; Salton, 2005; DePaoli-Roach, 2006).
Basándose en la especificidad por el fosfoaminoácido, las fosfatasas de tirosina (PTPasas) pueden dividirse en dos grandes grupos, las PTPasas específicas de tirosina y las fosfatasas de especificidad dual. Las fosfatasas específicas de tirosina sólo desfosforilan residuos de tirosina, pero no de serina/treonina; mientras que las fosfatasas de especificidad dual pueden desfosforilar tanto residuos de tirosina como de serina/treonina. Aunque la totalidad de las secuencias de proteínas de las fosfatasas de tirosina y de especificidad dual tienen poca homología, todas las PTPasas tienen una secuencia de aminoácidos totalmente conservada en el sitio activo [(V/I) HCXAGXGR (S/T)G], que rodea a un residuo de cisteina requerido para la formación del intermediario fosfoenzima (Luan et al., 2001; Luan, 2003; Salton, 2005; DePaoli-Roach, 2006).
Las fosfatasas específicas de tirosina son un diverso grupo de proteínas y, basándose en sus localizaciones subcelulares, estas fosfatasas pueden subdividirse en dos grupos: PTPasas parecidas a receptores y PTPasas intracelulares (Figura 5). Todas las PTPasas parecidas a receptores contienen un dominio extracelular de tamaño y composición variable, una región transmembranal simple y uno o dos dominios citoplásmicos catalíticos PTPasa. Las PTPasas intracelulares típicamente contienen un dominio catalítico simple y varias extensiones N- y C-terminal, que están involucradas en el sitio blanco o en otras funciones regulatorias (Luan et al., 2001; Luan, 2003; Salton, 2005; DePaoli-Roach, 2006).
Las PTPasas intracelulares también se caracterizan por sus dominios no catalíticos que sirven para localizar enzimas de membrana, núcleo, elementos del citoesqueleto y proteínas de señalización fosforiladas en tirosina (Luan, 2003; DePaoli-Roach, 2006).
Las PTPasas de especificidad dual también son proteínas intracelulares, pero tienen la característica de poder desfosforilar tanto residuos de tirosina como de serina/treonina. Las fosfatasas de especificidad dual representan también un gran número de proteínas con regiones catalíticas similares y con regiones no catalíticas distintas (Figura 5).
Las fosfatasas de tirosina de bajo peso molecular (LMW-PTPs) constituyen un grupo evolutivamente distinto, las cuales tienen convergencia en mecanismos de catálisis similares (Ramponi y Stefani, 1997).
Figura 5. Dominios estructurales de algunas fosfatasas de Tyr. Las PTPasas parecidas a receptores siempre tienen dos dominios catalíticos, mientras que las PTPasas intracelulares solo tienen uno. Las fosfatasas de especificidad dual son totalmente diferentes en secuencia, pero todas contienen un dominio catalítico idéntico (Luan et al., 2001).
En el pasado año 2000 se completó el genoma de Arabidopsis, y gracias a esto se pudieron realizar ensayos moleculares más precisos y confiables en el estudio de las fosfatasas de plantas. Es por eso que Kerk et al., (2002) se abocaron a la tarea de conocer cuántas y cuáles fosfatasas se encontraban presentes en el genoma de Arabidopsis. De modo que de 112 fosfatasas candidatas se encontró que en el genoma de Arabidopsis se encuentran en mayor cantidad las fosfatasas PP2C (69), sólo una PTP, 23 fosfatasas de la familia PPP, 18 de especificidad dual y una fosfatasa LMW-PTP. Algunas secuencias, en varias clases de fosfatasas, daban buenos resultados cuando se comparaban en el banco de datos, pero carecían de residuos catalíticos críticos, y por lo tanto, eran rechazadas como fosfatasas funcionales. Sin embargo, mantenían una relación evolutiva similar con las fosfatasas funcionales. Por otro lado, ocho secuencias son clasificadas aquí como nuevas candidatas de fosfatasas: cinco de especificidad dual y tres de PP2Cs (DePaoli-Roach, 2006).
b) Importancia de las fosfatasas de proteínas en plantas
Una característica común de las proteínas 14-3-3 es que tienen la capacidad de asociarse con proteínas blanco a través de uniones con motivos consenso que contienen residuos fosforilados (Muslin et al., 1996; Yaffe et al., 1997). Recientemente se ha observado que las 14-3-3 de plantas se asocian a proteínas como nitrato reductasa y sacarosa fosfato sintasa. Ya que la H+-ATPasa es una enzima que se fosforila in vivo cabe la posibilidad de que un mecanismo de fosforilación/desfosforilación regulado por proteínas cinasas y fosfatasas pueda regular la asociación entre la 14-3-3 y la H+-ATPasa (Camoni et al., 2000). Así que para verificar si el estatus de fosforilación de la H+-ATPasa modula la asociación con proteínas 14-3-3, Camoni et al., (2000) desfosforilaron a la H+-ATPasa empleando fosfatasa alcalina y probando la habilidad de ésta para unirse a una proteína 14-3-3 marcada con 32P. Los resultados mostraron que la H+-ATPasa desfosforilada era incapaz de unirse a proteínas 14-3-3, aunque la fucicoccina (toxina de Fusicoccum amygdali), la cual es una proteína de la familia de las 14-3-3, restauró parcialmente in vitro la habilidad de la H+-ATPasa para unirse a las 14-3-3. Los resultados obtenidos en los ensayos con la fosfatasa alcalina dieron a Camoni et al., (2000) las herramientas suficientes para investigar qué tipo de fosfatasa era capaz de modular la asociación de proteínas 14-3-3 con la H+-ATPasa en raíces de maíz. Para lograr esto, se tomaron muestras de citosol de raíces de maíz, a partir de las cuales se purificó una fosfatasa. A las fracciones obtenidas de esta purificación se les midió directamente la capacidad de inhibir la asociación entre las proteínas 14-3-3 y la H+-ATPasa. Se midió la actividad de fosfatasa en presencia de 1 ?M de ácido okadaico y 1 ?M de microcistina y se observó que la capacidad de asociación de las proteínas 14-3-3 con la H+-ATPasa se restauraba con 1 ?M de ácido okadaico. Posteriores ensayos bioquímicos e inmunológicos mostraron que la fosfatasa que modulaba la interacción H+-ATPasa/14-3-3 era una PP2A. La actividad de fosfatasa fue totalmente independiente de Ca2+ y Mg2+, además de ser sensible a ácido okadaico a concentraciones nanomolares (Armienta-Aldana y González de la Vara).
En ensayos donde se emplearon inmunosupresores, se vió que la actividad de calcineurina (PP2B) es fundamental para la modulación de la actividad de un canal iónico en membrana plasmática de células guarda (Luan et al., 1993). Además, se encontró que PP2B (de fuente animal) fue capaz de regular la actividad de canales iónicos de membrana plasmática y tonoplastos de células guarda y células de aleurona (Luan et al., 1993; Allen y Sanders, 1995; Bethke y Jones, 1997). Además, en recientes estudios se ha visto que la sobreexpresón de PP2B de levaduras, genera una tolerancia a estrés salino en tabaco transgénico (Kudla et al., 1999). Estos investigadores reportaron además las características moleculares y bioquímicas de la proteína AtCBL de Arabidopsis thaliana. Observaron que la expresión del gen AtCBL1 (que codifica para una proteína del tipo PP2B) es fuertemente regulada por señales de estrés tales como sequía, frío y herida, consistente con una posible función de esta fosfatasa en la respuesta a estrés por parte de la planta.
Por otro lado, la PP2B regula el flujo hacia dentro de cationes en todos los tejidos vegetales, teniendo esto importantes consecuencias. Movimientos de la planta, tales como heliotropismo, respuestas rápidas al contacto y cierre y apertura de los estomas, involucran cambios masivos en los flujos hacia adentro y afuera de la célula de iones K+ y Cl-, lo que altera la presión de turgencia. De modo que la PP2B es un elemento importante en la regulación de los mecanismos de las plantas. La PP2B también puede controlar el flujo de iones hacia adentro en la raíz, que es un proceso crucial para el crecimiento, desarrollo y supervivencia de la planta (Trewavas, 1999).
Se ha visto que la PP2B se encuentra unida a la membrana plasmática (Trewavas y Malhó, 1997) lo que susibe que PP2B podria tener una variedad de otras funciones en la membrana plasmática, es así que el tipo de unión a la membrana plasmático es de importancia para poder estudiar con más presición a las proteínas que interactuan con élla. En la Figura 6 podemos apreciar los diferentes tipos de uniones que las proteínas pueden tener con la membrana plasmática.
Figura 6. Diferentes clases de proteínas de membrana. 1. Proteínas con una substancial proporción de su estructura embebida en la bicapa. 2. Proteínas unidas a la bicapa por un glicosil-fosfatidilinositol, unido al C-terminal de la cadena polipeptídica. 3. Proteínas ancladas a la bicapa por un simple segmento transmembranal. 4. Proteínas asociadas a la bicapa por acil y/o diacilglicerol adiposos, unidos covalentemente al extremo N-terminal de la cadena polipeptídica (Harris y Angal, 1990).
MacKintosh y Meek (2001), observaron que la activación de la nitrato reductasa (NR) in vitro o en hojas en respuesta a la iluminación, es bloqueada por microcistina o ácido okadaico, sugiriendo que la activación es catalizada por una fosfatasa de la familia PPP (PP2A). Así mismo, ensayos de inhibición empleando ácido okadaico, han indicado que las PP1/PP2A están involucradas en la regulación de canales iónicos. Por ejemplo, el ácido okadaico inhibe la actividad de los canales de entrada de K+ en células guarda, pero activa los canales de salida de K+ en células de mesófilo de Vicia faba, sugiriendo que PP1/PP2A juegan un papel importante en la regulación de los diferentes canales de K+ en varios tipos de células. Además, el ácido okadaico también activa canales aniónicos en células guarda de Vicia faba y en Arabidopsis (Pei et al., 1997), implicando a PP1/PP2A en la regulación de canales aniónicos (Armienta-Aldana y González de la Vara, 2004).
Basándose en un análisis de secuencia, se encontró que el gen AtDsPTP1 puede codificar una fosfatasa de especificidad dual (DsPTPasa). En ensayos de desfosforilación donde se emplearon proteínas recombinantes, se demostró claramente que AtDsPTP1 fue capaz de hidrolizar tanto residuos de Ser/Thr como de Tyr en sustratos proteicos, aunque esta fosfatasa prefiere los residuos de Tyr a los de Ser/Thr (Gupta et al., 1998). Además, Xu et al., (1998) caracterizaron a una PTPasa específica de tirosina (AtPTP1) de Arabidopsis, la cual muestró cierta similitud en algunas secuencias con la fosfatasa de especificidad dual AtDsPTP1. Pero la diferencia más grande entre ambas se encontró en la especificidad por el sustrato. Ya que AtPTP1 despliega una mayor actividad hacia pNPP que hacia fosfoproteínas (Xu et al., 1998), en comparación con la AtDsPTP1, la cual en contraste, muestra una mayor actividad hacia proteínas fosforiladas que hacia el pNPP (Gupta et al., 1998).
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